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实验研究
CRELD1基因表达量对心内膜垫发育中相关基因的影响
中华实用儿科临床杂志, 2017,32(13): 1013-1017. DOI: 10.3760/cma.j.issn.2095-428X.2017.13.014
摘要
目的

探讨CRELD1基因表达量的改变对心内膜垫发育中相关基因的影响。

方法

通过慢病毒载体的构建实现CRELD1基因的过表达及沉默,然后用慢病毒载体感染人胚胎肺成纤维细胞(HFL-I),实验分为5组:空白对照组、干扰阴性对照(NC)组、干扰组、过表达NC组及过表达组。感染成功后,分别用实时荧光定量PCR(qPCR)和Western blot检测CRELD1Sox9AggrecanScleraxisTenascin-C的mRNA和蛋白表达。

结果

通过测序表明干扰载体pLV3-shRNA-CRELD1和过表达载体pLV4-CRELD1构建成功。感染慢病毒的HFL-I在荧光倒置显微镜下观察,满视野呈现明显的绿色荧光,表明感染成功。qPCR和Western blot的检测结果一致:Sox9Aggrecan的表达量在干扰组明显高于干扰NC组,在过表达组低于过表达NC组。而Scleraxis干扰组和过表达组均高于各自的NC组。Tenascin-C的表达量在干扰组明显低于干扰NC组,在过表达组高于过表达NC组。

结论

CRELD1基因对心内膜垫发育中的相关基因Sox9Aggrecan的表达量有负调节作用,对Tenascin-C的表达量有正调节作用。这对于阐明其在房室间隔缺损中的作用提供一定的理论基础。

引用本文: 陈璇, 秦玉明, 沈捷. CRELD1基因表达量对心内膜垫发育中相关基因的影响 [J]. 中华实用儿科临床杂志,2017,32( 13 ): 1013-1017. DOI: 10.3760/cma.j.issn.2095-428X.2017.13.014
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心内膜垫的发育是整个心脏发育的关键部分,其不仅参与瓣膜的形成,对心脏腔室间的隔膜也有作用。其发育经一系列复杂的信号通路调节[1,2],其中BMP-Sox9-Aggrecan和FGF-Scleraxis-Tenascin-C信号通路已研究较多[3,4,5,6],证明在心内膜垫的形成,延伸和塑性中发挥重要作用。心内膜垫的发育异常导致心内膜垫缺损。CRELD1基因是第1个被发现的与心内膜垫缺损的相关基因。本研究目的是检测CRELD1基因表达量变化时,心内膜垫发育中的相关转录因子Sox9Scleraxis及其相应的下游基因AggrecanTenascin-C表达量的变化,了解CRELD1基因在心内膜垫发育中的调节通路,为阐明其在心内膜垫缺损发生发展过程中的作用提供依据。

1 材料与方法
1.1 材料

人胚胎肺成纤维细胞(HFL-I)(上海生命科学研究院细胞资源中心);pLV3、pLV4 (上海Genepharma公司);α-最低必须培养基(α-MEM)、胎牛血清、2.5 g/L胰酶(美国Gibco公司);相关酶类Bbs I、BamH I、Not I、Nsi I(美国Fermentas公司);DNA凝胶回收试剂盒、Taq DNA聚合酶、莫洛尼氏鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶、RNA酶抑制剂(RNasin)(日本Takara公司);总RNA提取试剂Trizol Reagent(美国Invitrogen公司);实时荧光定量(Real-time) PCR反应试剂SYBR Green mixture(日本TOYOBO公司);CRELD1抗体、Sox9抗体、Aggrecan抗体、Scleraxis抗体、Tenascin-C抗体(英国Abcam公司);辣根过氧化物酶标记羊抗鼠的IgG、辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG(英国Jackson ImmunoReserch);荧光倒置显微镜(日本Nikon Eclipse Ti);定量PCR仪(美国Stratagene Mx3000p);电转仪、酶标仪(美国Bio-Rad公司)。

1.2 方法
1.2.1 细胞的培养

HFL-I常规培养于含150 g/L胎牛血清(FBS)的α-MEM培养基中,25 cm2培养瓶,37 ℃,50 mL/L二氧化碳(CO2)饱和湿度培养箱中培养。每2~3 d更换一次培养液,当细胞的融合度达到80%左右时,用2.5 g/L的胰酶进行消化传代,取第4~6代细胞用于实验。

1.2.2 干扰载体的构建

根据CRELD1的序列,选择一个位点设计siRNA,并在正义链模板的5′端添加GATCC,与BamHI酶切后形成的黏端互补;反义链模板的5′端添加AATTC,与EcoRI酶切后形成的黏端互补。序列如下:5′-GATCCGGAATCAAACTGTTTGCAATGTTCAAGAGACATTGCAAACAGTTTGATTCCTTTTTTG-3′,在PCR仪上经过退火处理后得到shRNA模板。用BamHI、EcoRI酶切pLV3载体,经琼脂糖电泳后切胶回收、纯化。用T4 DNA ligase对酶切产物及shRNA模板进行22 ℃ 1 h连接、转化、挑出克隆扩增,抽取质粒DNA后用BamHI、EcoRI内切酶进行双酶切鉴定,将阳性克隆送至上海华大基因公司测序,以确定干扰载体pLV3-shRNA-CRELD1的构建是否正确。

1.2.3 过表达载体的构建

CRELD1基因的引物序列使用Premier 5.0软件辅助自行设计,序列如下:F5′-GATATGCGGCCGCATGGCCCCATGGCCCCCGAAG-3′;R5′-GTATCATGCATTCATCTCTGAGAAGAAGCCTG-3′(分别加入NotI和NsiI及保护碱基,用于慢病毒载体的亚克隆),由上海吉玛公司合成。PCR反应条件为:95 ℃ 3 min预变性;94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,30个循环;72 ℃ 5 min。琼脂糖电泳鉴定并切胶回收CRELD1基因片段,送至上海华大基因公司测序。然后将测序正确的目的基因片段及pLV4质粒分别用NotI、NsiI内切酶酶切,酶切产物纯化后用T4 DNA连接酶进行22 ℃ 2 h连接、转化、挑出克隆扩增,抽取质粒DNA后用NotI、NsiI进行双酶切鉴定,将阳性克隆送至上海华大基因公司测序,以确定过表达载体pLV4-CRELD1的构建是否正确。

1.2.4 慢病毒的感染

上述构建好的干扰载体及过表达载体,由上海吉玛公司进行包装成慢病毒载体(L-pLV3-shRNA-CRELD1和L-pLV4-CRELD1),浓缩成1012/L的病毒原液。实验分为5组:空白对照组、干扰阴性对照(NC)组、干扰组、过表达NC组、过表达组。其中,空白对照未侵染任何质粒,作为干扰和过表达的空白对照。干扰NC组侵染L-pLV3-shRNA(干扰序列的无序片段),干扰组侵染干扰质粒L-pLV3-shRNA-CRELD1,过表达NC组侵染质粒L-pLV4,过表达组侵染过表达质粒L-pLV4-CRELD1。将慢病毒原液100 μL用含150 g/L FBS的α-MEM培液10倍稀释,并加入终浓度为5 μg/L的聚凝胺(Polybrene),感染常规培养的HFL-I细胞,于37 ℃、50 mL/L培养24 h,弃掉稀释病毒液后加入含150 g/L FBS的新鲜α-MEM培养基,于37 ℃,50 mL/L CO2继续培养72 h,收集细胞。

1.2.5 检测各基因mRNA水平和蛋白水平的表达量

用Real-time PCR检测细胞mRNA水平,每组有3个样本,每个样本有1个复空。以各自的阴性对照组为标准计算2-ΔΔCt值。利用公式:ΔCt=目的基因的Ct值-参考基因的Ct值,ΔΔCt=目标组ΔCt值-各自阴性对照组ΔCt值,然后算出2-ΔΔCt值。用Western blot检测细胞蛋白水平相关基因的表达量。以GAPDH作为内参基因。用目的条带与内参GAPDH的灰度值的比来作为目的蛋白的相对表达量(重复3次,取平均值),各自的阴性对照组目的蛋白的表达量校正为1。

1.3 统计学处理

采用SPSS 16.0统计软件进行数据处理,各组数据均以±s表示,组间两两比较采用单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 干扰载体的构建

干扰质粒pLV3-shRNA-CRELD1经测序鉴定,连接正确且无突变。测序图谱见图1

图1
重组干扰质粒pLV3-shRNA-CRELD1测序图谱(仅显示shRNA测序序列)
Figure 1

Sequencing map of interference vector pLV3-shRNA-CRELD1(only shRNA sequences were shown)

图1
重组干扰质粒pLV3-shRNA-CRELD1测序图谱(仅显示shRNA测序序列)
Figure 1

Sequencing map of interference vector pLV3-shRNA-CRELD1(only shRNA sequences were shown)

2.2 过表达载体的构建

质粒pLV4和CRELD1分别经过NotI/NsiI双酶切后连接,构成重组过表达质粒pLV4-CRELD1,对重组质粒进行NotI/NsiI双酶切,琼脂糖凝胶电泳,结果见图2。可见2条带,分别长约1 300 bp和8 800 bp,与理论值一致。对鉴定正确的质粒再测序,测序结果表明连接正确且无突变。

图2
重组质粒pLV4-CRELD1用NotI/NsiI双酶切鉴定电泳图
Figure 2

Electrophoresis of digestion products by NotI/NsiI of pLV4-CRELD1

注:1:CRELD1基因mRNA的CDS区域长约1.3 kb,LV4长约8.8 kb;2:Marker

1:The CDS region of the CRELD1 gene mRNA was about 1.3 kb,LV4 was about 8.8 kb;2:Marker

图2
重组质粒pLV4-CRELD1用NotI/NsiI双酶切鉴定电泳图
Figure 2

Electrophoresis of digestion products by NotI/NsiI of pLV4-CRELD1

2.3 慢病毒感染细胞结果

慢病毒感染细胞72 h后,在荧光倒置显微镜下观察,可见满视野转染阳性的HFL-I呈现明显的绿色荧光。表明感染成功,且感染率在90%以上,见图3

图3
感染72 h后明视野和相应的荧光视野下的人胚胎肺成纤维细胞状态(×100)
Figure 3

The efficiency of 72 h post-infection seen under converted fluorescence microscope(×100)

图3
感染72 h后明视野和相应的荧光视野下的人胚胎肺成纤维细胞状态(×100)
Figure 3

The efficiency of 72 h post-infection seen under converted fluorescence microscope(×100)

2.4 Sox9AggrecanScleraxisTenascin-C mRNA表达水平

CRELD1基因的mRNA表达量在干扰组明显低于NC组,在过表达组明显高于NC组,提示干扰载体和过表达载体的成功构建和感染。Sox9Aggrecan的mRNA表达量在干扰组高于NC组,在过表达组低于NC组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。而Scleraxis干扰组和过表达组均高于各自的NC组,差异均统计学意义(均P<0.05)。Tenascin-C的mRNA表达量在干扰组低于NC组,在过表达组高于对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。每个NC组的各基因mRNA表达量均和空白对照组作了比较,各基因的表达量没有明显差异。结果见表1

表1

Sox9AggrecanScleraxisTenascin-C  的mRNA的相对表达量(±s)

Table 1

The relative expression amount of Sox9AggrecanScleraxisTenascinC mRNA(±s)

表1

Sox9AggrecanScleraxisTenascin-C  的mRNA的相对表达量(±s)

Table 1

The relative expression amount of Sox9AggrecanScleraxisTenascinC mRNA(±s)

组别CRELD1Sox9AggrecanScleraxisTenascin-C
A组1.0001.0001.0001.0001.000
B组0.026±0.0081.617±0.0441.652±0.2111.765±0.1120.289±0.056
P0.0160.0020.0000.0050.025
C组1.0001.0001.0001.0001.000
D组1 335.000±177.1000.606±0.0720.144±0.0133.071±0.7212.762±0.273
P0.0000.0000.0020.0240.007

注:A组:干扰阴性对照组;B组:干扰组;C组:过表达阴性对照组;D组:过表达组

A:interfere negative control group;B:interfere group;C:over-expression negative control group;D:over-expression group

2.5 Sox9AggrecanScleraxisTenascin-C的蛋白表达水平

CRELD1基因的蛋白表达量在干扰组明显低于NC组,在过表达组明显高于NC组,提示干扰载体和过表达载体的成功构建和感染。Sox9Aggrecan的蛋白表达量在干扰组高于NC组,在过表达组低于NC组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。而Scleraxis在干扰组和过表达组均高于各自的NC组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。Tenascin-C的蛋白表达量在干扰组低于NC组,在过表达组高于对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。每个NC组的各基因蛋白表达量均和空白对照组作了比较,各基因的表达量差异无统计学意义。结果见图4

图4
CRELD1Sox9AggrecanScleraxisTenascin-C的Western blot结果
Figure 4

Expressions of CRELD1Sox9AggrecanScleraxisTenascinC detected by Western blot

图4
CRELD1Sox9AggrecanScleraxisTenascin-C的Western blot结果
Figure 4

Expressions of CRELD1Sox9AggrecanScleraxisTenascinC detected by Western blot

3 讨论

心内膜垫缺损又称房室间隔缺损(AVSD),是一种较常见的先天性心脏病。其发生机制尚未明了,在遗传学方面,目前已经发现2个与心内膜垫缺损有关的位点AVSD1和AVSD2,其中AVSD1位于染色体1p31-21,但尚未发现具体的相关基因[7];AVSD2位于染色体3p25,对应的基因为CRELD1,研究证实该基因为AVSD的易感基因[8,9,10]。在胚胎发育学方面,其主要病变的部位(房间隔下部、室间隔上部及二尖瓣、三尖瓣等组织)均由胚胎早期的心内膜垫发育而成,因此,任何可以影响心内膜垫发育的因素,均有可能导致AVSD的形成。

目前较常见的与心内膜垫发育有关的有骨形成蛋白(BMP)/成纤维生长因子(FGF)、表皮生长因子(EGF)等信号系统[11,12,13,14],BMP2与FGF在心内膜垫的生长中均是促进细胞外基质的增生。但EGF的作用是通过拮抗SMAD1/5/8磷酸化而抑制心内膜垫的生长。在后来的瓣膜塑性中BMP2与FGF4则是引导2个相互拮抗的信号通路使细胞向不同的方向分化。即BMP2通过促进SMAD1/5/8的磷酸化,继而上调转录因子Sox9及促进其下游的Aggrecan的表达,同时下调转录因子Scleraxis及抑制其下游的Tenascin-C的表达;FGF的作用正好相反,FGF4通过促进丝裂原蛋白活化蛋白激酶(MAPK)(ERK1/ERK2)的磷酸化而上调转录因子Scleraxis及抑制其下游的Tenascin-C的表达[13,14]

Sox9Aggrecan是软骨细胞的标志性基因,在骨骼的发育中起着重要作用。研究证明,在肢芽和肢节的发育中,BMP能够刺激Sox9的表达,进而促进其下游的硫酸软骨素糖蛋白Aggrecan在软骨祖细胞中的表达[15]。调节性敲除Sox9的小鼠表现出一系列的骨骼发育的异常[16,17]。令人惊奇的是,这一信号调节通路在心脏的瓣膜发育中也被发现。在鸡胚的瓣膜祖细胞中也可以观察到BMP2刺激Sox9的表达,进而促进Aggrecan的表达[14]。在鸡胚中,Sox9Aggrecan都主要表达于重组的心脏瓣膜的瓣叶上。体外分析来源于鸡胚的流出道(OFT)处心内膜垫的细胞,表明用BMP处理可以增加Sox9Aggrecan的表达,这和Smad1/5/8的磷酸化相关[18]。而用房室管(AVC)的细胞做体外实验可以得到相似的结论[11]。但用在心内膜垫融合后的胚胎做这个实验,BMP并不能改变Sox9Aggrecan的变化[19]。这说明BMP-Smad1/5/8-Sox9-Aggrecan信号通路在心内膜垫发育的过程中起重要作用,而且重点是调节瓣膜的瓣叶分化。ScleraxisTenascin-C是肌腱相关的基因,在骨骼的发育中发挥重要作用。在肢芽和肢节的发育中,FGF处理可增加ScleraxisTenascin-C的表达,这和ERK1/2的磷酸化增加相关[20,21,22]。在鸡胚中,ScleraxisTenascin-C都主要表达于重组的心脏瓣膜的支持结构上。房室瓣和半月瓣二者的结构和基因表达有所不同。房室瓣的瓣叶是有腱索牵拉与相应的乳头肌相连。而半月瓣没有腱索,只有瓣叶和其相应的支持结构。Aggrecan表达于房室瓣的瓣叶,而Tenascin-C表达于房室瓣的腱索上。两者在半月瓣中均有表达[18]。这也支持房室瓣和半月瓣在最初胚胎发育的过程中,基因的调控是基本一致的。研究证明,取心内膜垫未融合之前的组织(AVC处或OFT处均可)进行实验,用BMP处理或是抑制FGF信号增加Sox9Aggrecan的表达,相反用FGF处理或是抑制BMP增加ScleraxisTenascin-C的表达。而一旦心内膜垫融合之后,这些处理就不能引起其下游基因表达的变化[8,11,12]

本实验结果表明,在CRELD1过表达的情况下,Sox9Aggrecan的表达下降,而在CRELD1干扰的情况下,两者的表达量上升。这就是说CRELD1基因表达量的变化可以引起Sox9Aggrecan表达量的变化,而且是反方向的调节。CRELD1基因中存在EGF结构域,由于BMP信号通路和EGF信号通路存在相互交错的因子,因此,推测CRELD1基因通过这个EGF结构域来促进Sox9的表达,进而促进Aggrecan的表达。这与用BMP处理的AVC或是OFT处的胚胎的心脏组织是一致的[8,10,12]CRELD1基因表达量的变化引起Tenascin-C相同方向的变化,提示CRELD1基因可能同时调节对心内膜垫发育中起拮抗作用的2条信号通路BMP和FGF,而且调节部位位于上游,这可能是CRELD1基因影响心内膜垫发育的机制之一。

本实验结果中,Scleraxis的表达量的变化在干扰组和过表达组并非完全相反,与Tenascin-C的变化也不一致。而且在干扰组中上调的比例非常明显,Western blot的结果表明,Scleraxis干扰组上调将近40倍。推测CRELD1Scleraxis的调节可能存在一个反馈调节通路或是其间有其他的信号通路参与,这也提示CRELD1基因对心内膜垫发育的影响除了这2条经典的信号通路以外,可能还存在对其他信号通路的调节,这些需要进一步的实验来证明。

转录因子Sox9Scleraxis以及胞外基质蛋白Aggrecan和Tenascin-C均是房室瓣及其附属结构重要的成分[13,14],它们的异常表达可能导致房室瓣瓣叶及附属装置瓣环、腱索的发育异常,与心内膜垫缺损的发病有密不可分的关系。CRELD1表达量的变化可以引起它们量的变化,这提示CRELD1基因在心内膜垫的发育中起重要作用,对心内膜垫缺损的发生发展有一定影响。

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关键词
主题词
CRELD1基因
心内膜垫
干扰
过表达